Сартогосм О компании Статьи Современные подходы для трёхмерного культивирования

Современные подходы для трёхмерного культивированияЗаказать

Монослойная (2D) культура клеток лежит в основе современных научных знаний в области клеточной биологии, фармакологии, онкологии, молекулярной биологии, дифференцировки стволовых клеток (СК), морфогенеза тканей, динамического равновесия между функцией клеток и их взаимодействием с микроокружением. В то же время, в традиционной 2D культуре невозможно реконструировать то микроокружение клетки, которое существует in vivo, и, таким образом, поддерживать функции дифференцированных клеток. Методы культивирования клеток в трёхмерном пространстве (3D) способны устранить ограничения, свойственные 2D культурам. 3D системы включают в себя многочисленные, динамично взаимодействующие типы клеток и тканей, механические компоненты среды и биохимическое микроокружение. Каждый тип клеток in vivo находится в различном 3D микроокружении. Ниша СК по сути тоже трёхмерная, и её биохимия и топология сильно влияют на процесс дифференцировки клеток.

В настоящее время методы клеточной биологии, а также трёхмерное (3D) культивирование клеток млекопитающих приобрели приоритетное развитие в клинической медицине, биотехнологии и биофармацевтике. С помощью этих методов стало возможно получать клетки со специализированными свойствами, которые могут быть использованы для улучшения или восстановления функций тканей и органов, при исследовании нормальной физиологии и биохимии клеток, тестировании разнообразных химических соединений, лекарственных препаратов, пищевых добавок, синтезе ценных биологических веществ, токсикологическом тестировании (в качестве заменителя тестирования на животных). Клеточные технологии наряду с успехами физико-химических наук составили основу для развития тканевой инженерии и клеточной биотехнологии. Появление новых материалов и их сочетание с уникальными свойствами выделенных или модифицированных in vitro клеток позволило сделать определенные прорывы в области регенеративной медицины, трансплантологии, биотехнологии и биофармацевтики.

Одним из наиболее перспективных клеточных типов, которые используются для этих целей, являются мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), первоначально обнаруженные в строме костного мозга (КМ) [1], были затем найдены в других органах: плаценте, пуповине, печени и жировой ткани (ЖТ) [2, 3]. Международным обществом клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy (ISCT)) были установлены минимальные критерии, характеризующие ММСК [4]. Согласно определению, ММСК это группа гетерогенных клеток, адгезивных к пластику, которые могут быть выделены из костного мозга, жировой ткани, плаценты, пуповинной крови или из любых других тканей. ММСК не несут поверхностных маркеров, специфичных для гематопоэтических линий клеток (CD19, CD34, CD45 и HLA-DR), эндотелиальных клеток (CD31, CD144 и VEGFR-2) и позитивны по CD73, CD90, CD105, CD166, CD146 и NG2 [4, 5]. ММСК способны при индукции формировать мезодермальные клеточные популяции, из которых в ходе эмбрионального развития образуются костно-хрящевая ткань, строма КМ, мышцы, ЖТ и сухожилия [3, 5]. Другим преимуществом данных стволовых клеток (СК), объясняющим их широкое применение в клеточной терапии, является очень низкая иммуногенность, что обеспечивает возможность пересадки клеток от любого неродственного донора любому реципиенту без использования иммуносупрессивной терапии [6]. Кроме того, ММСК обладают иммуносупрессивными свойствами против Т-клеток [7], что делает эти клетки эффективными терапевтическими агентами при лечении больных с остро выраженной реакцией отторжения трансплантированной ткани по причине тканевой несовместимости. Благодаря вышеперечисленным свойствам, ММСК нашли применение в клеточной терапии широкого круга патологий, включая сердечно-сосудистые заболевания, инсульт, остеоартрит, несовершенный остеогенез, фиброз печени и др. ММСК, выделенные из КМ, способны секретировать как компоненты внеклеточного матрикса (ВКМ) (фибронектин, коллагены типа I, II, III, IV, V, VI, протеогликаны, ламинин) [8-9], так и комплекс цитокинов с противовоспалительным и антиапоптотическим действием, и хемокинов, участвующих в поддержании гемопоэза (ИЛ 6, ИЛ 7, ИЛ 8, ИЛ 11, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15, ИЛ-1α), факторы роста СК, гепатоцитов, макрофагов, гранулоцитарно-макрофагов [8]. Известен хоуминг-эффект ММСК КМ, реализующийся через выработку цитокина SDF-1 (Stromal cell-derived factor-1) [9]. Среди компонентов ВКМ, которые продуцируют ММСК, следует отметить фибронектин, ламинин, коллаген и протеогликаны, принимающие основное участие в организации межклеточного взаимодействия и формировании ВКМ в КМ и костной ткани. Доказано, что ММСК, выделенные из КМ, создают стромальное микроокружение, обеспечивающее индуктивными и регуляторными сигналами не только ММСК, но и гемопоэтические предшественники и другие немезенхимные СК КМ [5].

ММСК являются адгезивной клеточной культурой. Кинетика роста таких клеточных культур зависит от многих составляющих, в том числе от состава питательной среды, температуры, заряда, адгезивных свойств полимера и плотности посева клеток. Традиционно в последние десятилетия для культивирования ММСК используют культуральные флаконы, чашки Петри и многолуночные культуральные планшеты. К недостаткам такого культивирования можно отнести ограниченную площадь поверхности культивирования, что ведёт к быстрому заселению её клетками и снижению их пролиферативной активности вследствие контактного торможения, и истощение питательной среды. Приведённые причины обуславливают необходимость периодического рассеивания клеток с использованием новой культуральной посуды и новой питательной среды. Таким образом, наращивание адгезивной клеточной культуры традиционным способом in vitro - длительная, дорогостоящая многоэтапная манипуляция. Выход есть – трехмерное культивирование ММСК на макропористых микроносителях в одноразовых биореакторах. ММСК способны прикрепляться, заселять матрицу-носитель, дифференцироваться в заданном направлении и формировать трехмерные структуры, которые позволяют моделировать ту или иную ткань in vitro.

Выбор матриксов - первый ключевой этап для формирования подобного рода моделей. Основными критериями биологически совместимого матрикса для создания тканеинженерной конструкции должны быть: отсутствие цитотоксичности, поддержание адгезии, фиксации, дифференцировки или предотвращение дедифференцировки помещенных на её поверхность клеток, отсутствие воспалительной реакции на материал и иммунного ответа, достаточная механическая прочность в соответствии с назначением, биорезорбируемость обычными метаболическими путями. В настоящее время существует большое количество различных матриксов, которые отличаются по материалу, из которого изготовлены, форме, размеру, твёрдости, размеру пор, целевого назначения. Для создания матриксов используют природные и искусственные материалы. От их химического, физического и геометрического эффекта на носителе зависит область и возможность их использования.

Учёные во всем мире ведут работы по созданию, исследованию и возможностям применения различных 3D матриц-носителей, в том числе на основе природных материалов. Они могут быть классифицированы как белковые (коллаген, желатин, фибрин, матригель, эластин) и как полисахаридные (гиалуроновая кислота, хитозан, агар, декстран, альгинат) [10]. Такие матрицы-носители обеспечивают клеткам необходимое микроокружение для создания межклеточных взаимодействий и регуляторных систем межклеточных сигналов, а также стимулируют пролиферацию и функциональные характеристики в гораздо лучшей степени, чем традиционные двумерные (2D) культуры тканей.

Пористые гели являются перспективным материалом для создания матриксов для 3D культивирования клеток благодаря их способности воспроизводить основные свойства большинства мягких тканей. Ретикулярные структуры полимерных цепочек, соединенных поперечными связями, содержат большое количество воды, облегчают транспорт кислорода, питательных веществ и продуктов метаболизма, а также транспорт растворимых факторов. Многие гели могут формироваться при мягких условиях, благоприятных для живых клеток, и могут быть легко модифицированы для придания нужной вязкоэластичности и скорости деградации. Гель также может быть отделён от поверхности культурального сосуда, образуя плавающую пластину для выращивания клеток. В такой конфигурации клетки получают питательные вещества из среды, контактирующей с базальной стороной пластины, и имеют доступ к кислороду на поверхности [11].

Существенное внимание в решении поставленной проблемы уделяется белкам и углеводно-белковым комплексам, составляющим комплементарную структурную основу межклеточного белкового матрикса живых тканей и базальных мембран (коллагены разных типов, желатин, фибронектин, ламинин, нидоген, ряд гликопротеидов и протеогликанов и др.) и обладающим, как известно, выраженным влиянием на процессы пролиферации и дифференцировки клеток и формирование тканей. Использование природных гидрогелей (матригеля, фибриногеля и альгината) улучшает биосовместимость тканеинженерных матриксов и усиливает их заселение клетками. Альгинат является продуктом растительного происхождения и нашёл широкое применение в биологии, медицине и фармакологии с целью микрокапсулирования различных веществ, в том числе клеток млекопитающих [12].

Таким образом, использование природных биополимеров в создании биоинженерных каркасов позволяет максимально имитировать строение и свойства тканей и органов, а также создавать микроокружение со структурой, близкой к строению природных клеточных ниш. Это позволяет достигать эффективного заселения таких искусственных ниш стволовыми клетками и способствовать их практически полной дифференцировке в нужные типы клеток.

Выбор биореактора – второй ключевой этап для успешного трехмерного культивирования ММСК на матрицах-носителях. Оптимальным решением является использование волновых платформ (Biostat® Cultibag RM, Sartorius) с одноразовыми пластиковыми мешками различного объема. Технология качания использует механическую энергию для обеспечения равномерного перемешивания с наименьшим механическим воздействием на клетки. Интенсивность перемешивания зависит от скорости качания CultiBag RM и угла наклона платформы, создается интенсивное движение жидкости в одноразовом мешке. Таким образом, поверхность среды постоянно обновляется благодаря массообмену между свободным пространством и жидкостью. Одноразовые мешки снижают затраты времени и средств на валидацию технологического процесса. Благодаря проведенным исследованиям экстрагируемых и выщелачиваемых веществ, отсутствию необходимости очистки и стерилизации мешков, обеспечивается более комфортный процесс культивирования, а главное, что Biostat® Cultibag RM идеально подходит для использования в условиях GMP [13].

 

Список использованной литературы

1.                  Волкова И.М., Викторова Е.В., Савченкова И.П. и соавт. Характеристика мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота// Сельскохозяйственная биология. - 2012. – №. 2. – С. 32-8.

2.                  Dominici M., le Blanc K., Mueller I. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement// Cytotherapy. - 2006. - Vol. 8. - P. 315-7.

3.                  Russell K.C., Tucker H.A., Bunnell B.A. et al. Cell-surface expression of neuron-glial antigen 2 (NG2) and melanoma cell adhesion molecule (CD146) in heterogeneous cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells// Tissue Eng. - 2013. – Vol. 19 (№ 19 and 20). – P. 2253-66.

4.                  Le Blanc K. Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymal stem cells// Cytotherapy. - 2003. – Vol. 5. - № 6. – P. 485-9.

5.                  Beyth S., Borovsky Z., Mevorach D. Human mesenchymal stem cells alter antigen-presenting cell maturation and induce T-cell unresponsiveness// Blood. - 2005. – Vol. 105. - № 5. - P. 2214-9.

6.                  Dazzi F., Ramasamy R., Glennie S. et al. The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis// Rev. Вlood. - 2006. - Vol. 20. - P. 161-71.

7.                  Siegel G., Shaffer R., Dazzi F. The immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells// Transpl. – 2009. – Vol. 87. - № 9. - P. 45-9.

8.                  Lee J., Cuddihy M.J., Kotov N.A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art// Tissue Eng. Part B Rev. – 2008. – Vol. 14. - № 1. – P. 61-86.

9.                  Greiner A.M., Richter B., Bastmeyer M. Micro-engineered 3D scaffolds for cell culture studies. Review// Macromol Biosci. – 2012. – Vol. 12. - № 10. – P. 1301-14.

10.              Волкова И.М. Трёхмерные матриксы природного и синтетического происхождения для клеточной биотехнологии/ И.М. Волкова, Д.Г. Коровина// Биотехнология. - 2015. - № 2. - С. 8-26.

11.              Yoheno K. et al. Multidifferentiation potential of mesenchymal stem cells in 3-dimensional collagen gel cultures// J Biomed Mat Res A. – 2005. - 75(3). – P. 733-41.

12.              Elliott N.T., Yuan F. Review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies// J Pharm Sci. – 2011. – Vol. 100. – P. 59-74.


Сартогосм О компании Статьи Современные подходы для трёхмерного культивирования
Напишите нам:
Запрос успешно отправлен!
Вернуться на главную
Напишите нам:
Запрос успешно отправлен!
Вернуться на главную
Запросить каталог
Фамилия и имя
Ваш email
Телефон

Отправляя сообщение через форму связи, я соглашаюсь на обработку персональных данных.

Запросить каталог
Вернуться на главную
Запросить каталог
Фамилия и имя
Ваш email
Телефон

Отправляя сообщение через форму связи, я соглашаюсь на обработку персональных данных.

Запросить каталог
Биопроцессы pdf, 2.51 mb
Вернуться на главную
ФИО
Краткое описание
Компания
Некорректно заполненное поле
Email

Отправляя запрос через форму, я соглашаюсь на обработку персональных данных.

▲ Наверх