Обнаружение аэрозольных частиц вируса гриппа А

Метод отбора проб вирусных частиц

Обнаружение аэрозольных частиц вируса гриппа А (H3N2) в детской поликлинике г. Грайфсвальд (Германия) путем отбора вирусов, содержащихся в воздухе, с помощью водорастворимых желатиновых мембранных фильтров 12602 Sartorius Stedim Biotech

Введение

Такие пробоотборники воздуха, как импинджеры и импакторы, в основе работы которых лежит метод импакции, давно доказали свою эффективность для отбора проб микробных аэрозолей. Однако с относительно недавнего времени всё большее внимание исследователей привлекает отбор проб фильтрацией, в особенности с момента изобретения водорастворимых желатиновых фильтров, поскольку возможности данного метода очень широки для работы с бактериальными аэрозолями. С этого времени компания Sartorius Stedim Biotech GmbH, расположенная в городе Гёттинген в Германии, начала коммерческое производство желатиновых фильтров в промышленных масштабах.

До недавних пор фильтры ограниченно применялись при обнаружении и отборе вирусов из аэрозолей, поскольку использование фильтров считалось эффективным только в случае стабильных и резистентных вирусов, если вообще было возможно. Вплоть до недавнего времени экспериментальные данные о применении фильтров в данной области были очень скудными.

Исследования, проведенные группой д-ра Хельмута Яшхофа с использованием экспериментально полученных аэрозолей коли-фагов T1 и T3, а также вирусов гриппа (штамм A|PR|8|34 (H1N1)), показали, что применение желатиновых фильтров (типа 12602) производства Sartorius Stedim Biotech обеспечивает стабильную эффективность отбора указанных вирусных частиц даже при высоких скоростях входящего потока (до 1,6 м/с) и длительном времени отбора (до 15 мин.).

Высокая механическая стабильность желатинового фильтра и хорошо известная устойчивость вируса гриппа позволили испытать эффективность данного метода на практике в условиях сезонного пика острых респираторных заболеваний (ОРЗ) в начале 1990 г. (3-я – 5-я неделя). Данное исследование основано на результатах испытаний с использованием экспериментально полученных аэрозолей вирусов и бактериофагов.

Пробы воздуха отбирали на протяжении 3 дней в помещении приемного покоя детской поликлиники г. Грайфсвальда. Далее водорастворимые фильтры с отобранным материалом помещали в среду для культивирования вирусов. Параллельно проводились эксперименты по культивированию вирусных частиц из назального секрета пациентов детского возраста, поступивших в приемный покой с недавно выявленными ОРЗ.

Материалы и методы

Исследованное помещение: Приемный покой детской поликлиники г. Грайфсвальда (объем помещения — приблизительно 120 м³), который на протяжении 2 часов посетили не более 57 детей в сопровождении родителей (24 января 1990 г.). Температура: +25 °C, относительная влажность 60 %.

Экспериментальная часть | Материалы исследования:

Назальный секрет пациентов детского возраста с недавно выявленными ОРЗ. Желатиновый фильтр типа 12602, через который было пропущено 1,8 м³ воздуха исследуемого помещения. Затем фильтр упаковывали в полиэтиленовый пакет, в который предварительно добавили 5 мл изотонического буферного раствора для культивации клеток (pH 7,4), содержащего 0,5%-ный дрожжевой экстракт (Difco), пенициллин G (400 ЕД/мл) и стрептомицин (400 мкг/мл). Все образцы выдерживались в течение 4 часов (для промежуточного хранения использовалась холодильная камера).

Отбор проб воздуха:

Фильтрование воздуха производилось в течение 3 дней с пропусканием 1,8 м³ воздуха через каждый желатиновый фильтр производства Sartorius Stedim Biotech (тип 12602-050) каждые 15 минут на скорости потока воздуха 120 л/мин.

Вирусологические анализы:

Назальный секрет: К пробам добавили раствор Ханка (по 3 мл на каждую пробу) и центрифугировали в течение 30 мин на скорости 3000 об/мин с добавлением 10 мкл раствора антибиотика на 1 мл супернатанта, после чего проводили инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре. Амниотическую жидкость куриных яиц, подвергавшихся инкубации на протяжении 10 дней, высевали вместе с данными пробами и инкубировали в течение 3 дней при температуре +33 °С. Были приготовлены 3 пересеянных культуры для слепого исследования; вирусы выявляли с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Пробы воздуха:

Материал фильтров растворяли с добавлением буфера при нагревании на водяной бане в течение 5 мин и при температуре +37 °С. Как описывалось выше, раствор антибиотика добавляли к суспензии, которую использовался для инокуляции инкубированных куриных яиц. Затем в среде культивировали клетки человеческого амниона линии FL и клетки асцитной карциномы. Для обнаружения вирусов использовали стандартные методы: РТГА, тест на наличие цитопатического действия (ЦПД) и реакцию на торможение гемадсорбции (РТГад).

Вирус гриппа, полученный из назальных выделений, типировали и идентифицировали путем перекрестного титрования, используя реакцию пассивной гемагглютинации с иммунными сыворотками крови кролика, содержащими антитела к вирусу гриппа A|Greifswald|1|89 (H1N1) и A|Greifswald|1|90 (H3N2) и антигены вируса гриппа A|Sichuan|2|87 (H3N2) и вируса гриппа A|Greifswald|2|88 (H3N2).

Вирусные РНК и паттерны белков вирусов определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле.

Обсуждение результатов

Из экспериментальных материалов, отобранных 24 января 1990 г., были выделены три типа вирусов из назального секрета и вирус гриппа А из пробы воздуха. Данные вирусы были успешно культивированы в среде инкубированных куриных яиц с эмбрионами во время третьего пассажа с целью пересева (вирус гриппа A|Greifswald|2|90 [H3N2]).

Анализ методом РТГА показал, что антигены выделенных вирусов и антигены вариантов A|Greifswald|2|88 и A|Sichuan|2|87 были в целом аналогичными и не отличались от штамма, культивированного из носовых выделений пациента, который находился в помещении во время отбора проб воздуха с помощью фильтров (вирус гриппа A|Greifswald|1|90 [H3N2]).

Скорости миграции белков выделенных вирусов (HA, NP, NS и M) и все полосы вирусных РНК, полученные методом электрофореза в полиакриламидном геле, имели высокую степень соответствия (см. Рис. 1). Попытки выделения других вирусов из проб воздуха с помощью клеточных культур оказались неудачными.

Взятие проб во время преэпидемической фазы распространения ОРЗ подтверждает эффективность метода сбора с помощью фильтров для обнаружения аэрозольных частиц вируса гриппа.

75 % детей (в возрасте от 8 лет), находившихся в помещении в день исследования, имели респираторные инфекции, но острые катаральные симптомы (кашель, чихание, насморк) проявлялись у не более чем 40 % пациентов. Обнаружение вируса гриппа А в воздухе приемного покоя детской поликлиники в период незначительного увеличения сезонной заболеваемости ОРЗ в регионе хорошо подтверждает* результаты, полученные при использовании экспериментально созданных статических аэрозолей коли-фагов и вируса гриппа А.

Это подтверждает в первую очередь практическую пригодность желатиновых фильтров для отбора из воздуха частиц респираторных вирусов.

* (см. примечания об использовании фильтров Sartorius Stedim Biotech, № публикации SLF4028-e)

Перспектива применения

Учитывая относительное сокращение трудозатрат при использовании несложного метода фильтрования, применение желатиновых мембранных фильтров может считаться перспективным средством для анализа возникновения, стабильности и распространения инфекционных вирусных аэрозолей (например, в области генной инженерии).

Рис. 1.

Разделение вирусных РНК методом электрофореза в полиакриламидном геле. Анализ проводился для вируса гриппа A|Greifswald|1|90 (H3N2) (выделен из проб пациентов) и вируса гриппа A|Greifswald|2|90 (собран и выделен из воздуха). Использовали 3,5%-ный полиакриламидный гель в трис-ацетатном буфере с ЭДТА.

Дополнительный выпуск сокращенной текстовой версии стендового доклада, представленного на Ежегодной конференции Вирусологического общества (Потсдам, 19–23 марта 1991 г.).

Имена и адреса авторов:

Д-р Хельмут Яшхоф, ведущий научный сотрудник в области естественных наук

Герхард-Кач-штрассе, 14, 17489 Грайфсвальд, Германия

Э.-Й. Финке, доктор медицины, Госпиталь Бундесвера, Берлин

Шарнхорстштрассе, 13, 10115 Берлин 1040, Германия

Д-р Б. Херрманн, ведущий научный сотрудник в области естественных наук и А. Райнекке

Институт медицинской микробиологии и эпидемиологии, Грайфсвальдский университет им. Э.М. Арндта, Мартин-Лютер-штрассе, 6, 17489 Грайфсвальд, Германия